| Title | Amoeba proteus 공생 세균의 groEx를 응용한 온도 감응 발현 벡터의 개발 | ||
| Author | 이정은 · 황재성 · 안태인 * | ||
| Address | 서울대학교 생물교육과 | ||
| Bibliography | Korean Journal of Microbiology, 32(6),501-509, 1994 | ||
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| Key Words | Expression vector, plasmid, groE, heat shock promoter | ||
| Abstract | 아메바의 공생 세균에서 클로인한 groEx 유전자는 열충격과 관계 없이 groELx를 강력 발현하는 2종의 프로모터(pgroEx)와 특이한 전사 종결 요소를 가지고 있다. 이 강력 프로모터를 응용한 발현 벡터를 개발하기 위하여 유전자 재조합에 의해 groELx-융합 단백질 발현 벡터(pUXGPRM)를 생산하였다. 이 벡터는 4.1kb로 groEx 프로모터 및 GroELx의 N-말단 31개의 아미노산에 대한 코돈과 그 하단에 9종의 제한효소 자리(MCS)를 가지고 있다. 이 벡터의 유용성을 확인하기 위하여 BamH1 자리에 lactose operon의 구조 유전자(6.1kb)를 삽입하여 pUXGPRM-lac을 제조하고, pUXGPRM-lac으로 lac^- E. coli를 형질전환시켜 β-galactosidase의 발현량을 조사해본 결과 22~37℃ 온도 범위에서 안정적으로 강력한 발현이 이루어졌으며, pBSKII(Stratagene)의 plac 프로모터를 IPTG로 유도 발현시킨 것의 1000배 수준이었다. 이 강력 프로모터를 응용하여 native protein을 생산하기 위한 2단계 발현 벡터로 ATG-발현 벡터, pXGPRMATG를 개발하였다. pXGPRMATG는 groEx의 P2 프로모터 및 Shine-Dalgano 서열을 포함하고 있으며, groELx 개시코돈 자리에 NcoI을 비롯한 11개 제한 효소자리를 가지고 있다. 이 발현 벡터의 유용성을 검증하기 위하여 hGH, IGF1또는 SAM-synthetase cDNA를 삽입하여 발현 실험한 결과 모든 경우에 있어서 유도제의 첨가 없이 단순한 37℃ 배양에서, pBSKII 벡터에서 IPTG로 유도 발현 시킨 생산량 이상의 발현이 이루어짐을 SDS-PAGE 와 Western blotting으로 확인하였다. 이로써 본 연구에서 신개발된 pUGPRM과 pXGPRMATG 벡터는 37℃ 배양 온도 만으로 발현이 유도되며, 각각 GroEL-융합 단백질과 native protein을 생산하는 벡터로서 실용성을 입증하였다. | ||
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